蘋果酸脫氫酶（MDH）-測(cè)定試劑盒

（測(cè)組織 紫外法）

二、測(cè)定原理：

蘋果酸脫氫酶（Malate Dehydrogenase, MDH）催化的氧化還原反應(yīng)伴隨著 340nm 處吸光度的降低，通過(guò)測(cè)定每分鐘吸光度的變化來(lái)計(jì)算蘋果酸脫氫酶的活力。

三、測(cè)定意義：

MDH 與植物代謝的多條重要途徑有密切關(guān)系，它在運(yùn)轉(zhuǎn)物質(zhì)和能量的 Mal/OAA（蘋果酸/ 草酰乙酸）和 Mal/Asp（蘋果酸/天冬氨酸）穿梭中起重要作用；在光呼吸中，MDH 為 Gly 氧化提供 NAD+；在線粒體中，MDH 還是決定 TCA 運(yùn)轉(zhuǎn)速度的調(diào)節(jié)酶之一；在細(xì)胞溶質(zhì)中，MDH 與丙酮酸支路相聯(lián)系。所以 MDH系統(tǒng)不僅是研究酶區(qū)域化和酶調(diào)節(jié)的好系統(tǒng)，也為研究各細(xì)胞器之間的聯(lián)系和許多發(fā)育問(wèn)題提供了方便。根據(jù)近幾年文獻(xiàn)報(bào)道，該酶不僅與植物病理有關(guān)，還與抗凍，抗鹽有關(guān)。MDH 與抗熱的關(guān)系僅見(jiàn)于對(duì)嗜熱菌的報(bào)道。

四、操作步驟：

1、10%勻漿液的制備：準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量(g):體積(mL)=1:9 的比例加入 9 倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿,2500 轉(zhuǎn)/分,離心 10 分鐘，取上清液進(jìn)行測(cè)定（具體參照實(shí)驗(yàn)方法學(xué)）根據(jù)各種組織中 MDH 活力的不同再用生理鹽水按不同的比例將 10％的勻漿上清液稀釋成0.2％,0.1%等不同的濃度待測(cè)

2、參考取樣濃度：肝臟勻漿一般為 0.2％；肌肉勻漿一般為 0.5％

3、操作過(guò)程：

a、將紫外分光光度計(jì)于 340nm 處,0.5cm 光徑石英比色皿,以雙蒸水調(diào)零 (石英比色皿準(zhǔn)備兩只,一只用于調(diào)零,一只用于測(cè)定)。

b、將工作液，37℃預(yù)溫 3 分鐘以上。

c、往相應(yīng)編號(hào)的試管中加入 50μL 待測(cè)樣本，取 1mL 工作液迅速?zèng)_入試管中，立即混勻并計(jì)時(shí)。(空白管取50μL 雙蒸水,加入 1mL 工作液,其它操作與測(cè)定相同)

d、迅速倒入石英比色皿中在紫外分光光度計(jì) 340nm 處比色，20 秒時(shí)讀取吸光度值（A1 值）,在 1 分 20 秒時(shí)再次測(cè)定吸光度值（A2值）；

e、求出 2 次吸光度差值（△A=A1-A2）。

[注]：空白管只須做 1～2 只 (空白 OD 很穩(wěn)定)；若△A 測(cè)定/分鐘＜0.05 則需加大樣本的濃度；否則影響檢測(cè)結(jié)果；若△A 測(cè)定/分鐘＞0.3，則需將樣本的濃度稀釋后再測(cè)；否則影響檢測(cè)結(jié)果。

請(qǐng)?jiān)谂繖z測(cè)前一定要取正常對(duì)照組樣本做此樣本濃度的預(yù)試

附錄Ⅰ:小鼠肝組織勻漿反應(yīng)曲線

1、樣本來(lái)源：取小鼠新鮮肝臟，用生理鹽水制成 10%的勻漿液再用生理鹽稀釋成 0.2%待測(cè)。

2、操作過(guò)程：

a、將紫外分光光度計(jì)于 340nm 處,0.5cm 光徑石英比色皿,以雙蒸水調(diào)零 (石英比色皿準(zhǔn)備兩只,一只用于調(diào)零,一只用于測(cè)定)。

b、將工作液，37℃預(yù)溫 3 分鐘以上。

c、往相應(yīng)編號(hào)的試管中加入 50μL 待測(cè)樣本，取 1mL 工作液迅速?zèng)_入試管中，立即混勻并計(jì)時(shí)。(空白管取50μL 雙蒸水,加入 1mL 工作液,其它操作與測(cè)定相同)

d、迅速倒入石英比色皿中在紫外分光光度計(jì) 340nm 處比色，20 秒時(shí)讀取吸光度值（A1 值）,在 1 分 20 秒時(shí)再次測(cè)定吸光度值（A2值）；

e、求出 2 次吸光度差值（△A=A1-A2）。

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