人外周淋巴細(xì)胞分離液使用操作步驟

規(guī)格：200mL

保存條件：本產(chǎn)品對光敏感，應(yīng)該室溫避光儲存，保質(zhì)期1年。無菌開封后，保存于室溫。

產(chǎn)品簡介：

本產(chǎn)品是一種用于分離人外周血淋巴細(xì)胞的無菌、低內(nèi)毒素水平的密度梯度分離液。適用于從血液分離所需細(xì)胞，在醫(yī)療和醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)用。其分離原理是根據(jù)血細(xì)胞的密度差異（紅細(xì)胞和粒細(xì)胞密度為1.090 g/mL左右；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞密度為1.075~1.090 g/mL；血小板為1.030~1.035 g/mL），通過離心使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將淋巴細(xì)胞從人外周血或臍帶血中分離出來。

產(chǎn)品指標(biāo)：

密度             1.077±0.001g/mL

滲透壓                         290~350 mOsm/kg H2O

無菌                           0.1μm 濾膜過濾

操作步驟： 

1. 取新鮮抗凝全血（EDTA、枸櫞-酸鈉或肝素抗凝均可）或者去纖維蛋白血液，用等體積的全血及組織稀釋液或者PBS稀釋全血。

2. 在離心管中加入適量分離液（當(dāng)稀釋后血液體積小于3mL時，加入3mL分離液；大于等于3mL，加入等體積分離液。但二者的總體積不能超過離心管的三分之二，否則會影響分離效果），將稀釋后的血液平鋪到分離液液面上方，注意保持兩液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后將血液小心的平鋪于分離液上，因為兩者的密度差異，將形成明顯的分層界面。如果樣品較多加樣時間較長，在離心之前出現(xiàn)紅細(xì)胞成團下沉屬正常現(xiàn)象。）

3. 室溫，水平轉(zhuǎn)子500~1000g，離心20~40min（血液的體積越大所需的離心力越大，離心時間越長，最佳的分離條件需摸索，離心轉(zhuǎn)速最大不超過1200g）。

4. 離心后將出現(xiàn)明顯的分層：最上層是稀釋的血漿層，中間是透明的分離液層，血漿與分離液之間的白膜層即為淋巴細(xì)胞層，離心管底部是紅細(xì)胞與粒細(xì)胞。

5. 小心的吸取白膜層細(xì)胞到15mL潔凈的離心管中，10mL PBS或細(xì)胞洗滌液洗滌白膜層細(xì)胞。250g，離心10min。

6. 棄上清，5mL的PBS或細(xì)胞清洗液重懸細(xì)胞，250g，離心10min。

7. 重復(fù)步驟6。

8. 棄上清，細(xì)胞重懸備用。

注意事項：

a) 開封前顛倒混勻，本分離液為無菌產(chǎn)品，為延長分離液保存時間，請在無菌條件下啟封，避免微生物污染。

b) 分離液使用時應(yīng)始終保持室溫（18℃~25℃），如室內(nèi)溫度較低，可將分離液預(yù)熱。4℃或者是溫度較低的條件下離心，可能會導(dǎo)致白膜層中紅細(xì)胞污染加重。 

c) 血液樣本最好為新鮮抗凝血（采血2 h以內(nèi)），為保持淋巴細(xì)胞的活性，應(yīng)避免冷凍和冷藏。

d) 稀釋血液或洗滌細(xì)胞，不可使用含Ca、Mg離子的緩沖液及培養(yǎng)液，其成分會導(dǎo)致血細(xì)胞凝集，大大降低細(xì)胞得率及純度。

e) 部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其帶有的靜電作用，可能會導(dǎo)致細(xì)胞掛壁，影響分離效果。

f) 血液樣本的粘稠度或者是溫度差異，可能會影響分離效果，可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)和離心時間，摸索最佳的分離條件。

g) 吸取過多的淋巴細(xì)胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加；吸取過多的血漿層可能會導(dǎo)致淋巴細(xì)胞中血漿蛋白及血小板污染。

h) 如果要進一步對分離的細(xì)胞進行培養(yǎng)，那在收集血液和分離過程中，注意無菌操作，避免微生物污染。

i) 不同動物血液在不同比重分離液中的細(xì)胞離散系數(shù)及細(xì)胞帶電不同，用戶在制定分離液時應(yīng)提供所需分離液的比重、動物種屬及被分離細(xì)胞的名稱。