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免疫組化實(shí)驗(yàn)代測(cè)
免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理一抗原抗體反映，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反映使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistry）或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（immunocytochemistry）。

服務(wù)說(shuō)明

冰凍切片免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟

1、 冰凍切片固定：冰凍切片室溫晾干，置于冷丙酮固定10min，于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

2、 抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH9.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。中低火10-15min，斷電間隔10min轉(zhuǎn)至中低火10-15min，此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織來(lái)確定）

3、 阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：切片放入3%過(guò)氧化氫溶液，室溫避光孵育25min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

4、 BSA或者血清封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內(nèi)滴加用3%BSA或者10%正常兔血清均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。（一抗是山羊來(lái)源用10%正常兔血清封閉，一抗其它來(lái)源的用3%BSA封閉）

5、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

6、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加組化試劑盒內(nèi)與一抗相應(yīng)種屬的二抗（HRP標(biāo)記）覆蓋組織，室溫孵育50min。

7、 DAB顯色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽(yáng)性為棕黃色，自來(lái)水沖洗切片終止顯色。

8、 復(fù)染細(xì)胞核：Harris蘇木素復(fù)染3min左右，自來(lái)水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗。

9、 脫水封片：將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min --無(wú)水乙醇Ⅰ6min -無(wú)水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ5min 中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來(lái)稍晾干，中性樹膠封片。

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石蠟切片免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟

1、 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸餾水洗。

2、 抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH9.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，中火8min至沸，?；?/span>8min保溫再轉(zhuǎn)中低火7min，此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

3、 阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：切片放入3%過(guò)氧化氫溶液（雙氧水：純水=1:9），室溫避光孵育25 min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

4、 BSA或者血清封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內(nèi)滴加用3%BSA或者10%正常兔血清均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。（一抗是山羊來(lái)源用10%正常兔血清封閉，一抗其它來(lái)源的用3%BSA封閉）

5、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

6、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗（HRP標(biāo)記）覆蓋組織，室溫孵育50min。

7、 DAB顯色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽(yáng)性為棕黃色，自來(lái)水沖洗切片終止顯色。

8、 復(fù)染細(xì)胞核：Harris蘇木素復(fù)染3min左右，自來(lái)水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗。

9、 脫水封片：將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min --無(wú)水乙醇Ⅰ6min -無(wú)水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ5min 中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來(lái)稍晾干，中性樹膠封片。

10、 顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

幾種常用的免疫組織化學(xué)方法的原理

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

將已知抗體標(biāo)上熒光素,以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原,在熒光顯微鏡下觀察.當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光,從而可以確定組織中的抗原定位或定量.

免疫酶細(xì)胞化學(xué)

是目前免疫組織化學(xué)研究中zui常用的技術(shù).基本原理是先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過(guò)光鏡或電鏡，對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原進(jìn)行定位或定性研究.

免疫膠體金技術(shù)

就是用膠體金標(biāo)記一抗，二抗或其他的能特異性的結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性，定位或定量研究.由于膠體金的電子密度高，多用于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記的定位研究.

免疫組織化學(xué)的全過(guò)程包括：①抗原的提取與純化;③免疫動(dòng)物或細(xì)胞融合，制備特異性抗體以及抗體的純化;③將顯色劑與抗體結(jié)合形成標(biāo)記抗體;④標(biāo)本的制備;③免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)以及呈色反應(yīng);⑧觀察結(jié)果。

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二、免疫組織化學(xué)基本技術(shù)

1.材料

免疫組織化學(xué)可用于多種材料.如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,人體組織,細(xì)胞和體外培養(yǎng)細(xì)胞都可用于免疫組化研究.

一.)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物　種類很多，以狗，兔，大鼠和小鼠zui為常用.關(guān)鍵是取材迅速，大小適宜，固定充分.

二.)人體材料　包括活檢和手術(shù)切除的標(biāo)本，以及通過(guò)各種手段收集的細(xì)胞都可用于免疫組化研究.如　脫落細(xì)胞　穿刺涂片　骨髓涂片　血涂片等.

三.)體外培養(yǎng)的細(xì)胞標(biāo)本　根據(jù)所培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性采用不同的方法.對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞可采用在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底部放置載玻片，讓細(xì)胞在其上面生長(zhǎng)，到時(shí)將載玻片取出進(jìn)行固定，染色.懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可采用離心涂片或離心后細(xì)胞團(tuán)塊固定，脫水，包埋，切片的方法進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究。

2 .固定

固定的目的在于保持組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整，盡量保存組織中的抗原，使其不被破壞或擴(kuò)散，以減少非特異性染色或假陽(yáng)性，假陰性的結(jié)果.

選擇固定方法的原則是:

在保持組織形態(tài)的完好和被檢測(cè)抗原的前提下,盡量應(yīng)用濃度zui低的固定劑及zui短的固定時(shí)間.

常用固定劑

一.)醛類固定劑 起作用是使組織之間相互交聯(lián),將抗原保存在原位.此類固定劑的特點(diǎn)是對(duì)組織的穿透力強(qiáng),組織收縮性小.常用的有甲醛,多聚甲醛和戊二醛.可單用也可聯(lián)合使用.

(1)3% 中性甲醛固定液液:

配制: 30%甲醛10ml, 0.01mol/L PH 7.4 PBS 90ml

特點(diǎn): 滲透性好,能完好地保護(hù)組織結(jié)構(gòu)和某些抗原.由于交 聯(lián)作用會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性,會(huì)遮蔽部分抗原,染 色 前用酶消化,以暴露抗原決定簇.

(2)4%多聚甲醛緩沖液:

配制: 40g多聚甲醛溶于0.1mol/L PBS 500ml, 加熱 攪拌(注意不要沸騰)至溶液清亮后，室溫下冷卻后加PBS, 使總?cè)萘繛?000ml

特點(diǎn)：此固定劑對(duì)抗原的保護(hù)優(yōu)于甲醛緩沖液但價(jià)格高與甲醛

(3)戊二醛-多聚甲醛緩沖液

配制：在上述溶液中加入1%的戊二醛.

特點(diǎn)：多用于電鏡的免疫組織化學(xué)研究

(4)Bouin液

配制：40%甲醛250ml，冰醋酸50ml,飽和苦味酸750ml.

特點(diǎn)：穿透力強(qiáng)，組織收縮小. 比單獨(dú)用甲醛固定更適合于免疫組織化學(xué)研究

(5) PLP液 (過(guò)碘酸-賴氨酸-多聚甲醛固定液)

此固定劑比較適合富含糖類組織的固定,對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的保存均較好, 但配制比較繁瑣

二.)丙酮及醇類固定劑

固定原理是使組織中的蛋白質(zhì)和糖類沉淀.此類固定劑的穿透能力強(qiáng),對(duì)抗原保存較好,但對(duì)小分子蛋白質(zhì)及多肽等物質(zhì)的保存效果較差.常與其他固定劑 如 冰醋酸,乙醚,氯等混合使用.

(1)AAA液: 純酒精85ml，冰醋酸5ml，濃甲醛10ml

(2)Clzrke液：純酒精95ml，冰醋酸5ml 多用于冰凍切片的后固定

(3)Carnoy液: 純酒精60ml，氯30ml，冰醋酸10ml. 多用于癌基因蛋白，抗癌基因蛋白等抗原 的固定保存。

(4) 丙酮：常用于冰凍切片和細(xì)胞涂片的后固定。用前在4度冰箱預(yù)冷，切片在冷丙酮中固定5～10min.

三.)其他固定劑

(1) Zenker液 適合免疫球蛋白抗原的檢測(cè)。

(2) 四氯化鋨液 是電鏡研究中所必需的固定液

選擇*固定劑的標(biāo)準(zhǔn)是：

組織形態(tài)保存良好; zui大限度地保存抗原的抗原性。中性甲醛和多聚甲醛是應(yīng)用zui廣的固定劑。

3. 包埋

包埋的目的是使組織保持一定的形狀和硬度，便于用切片機(jī)切片.常見的包埋劑及方法如下:

石蠟包埋 石蠟是組織病理切片中zui常用的包埋劑. 需要脫水, 透 明,浸臘等過(guò)程.

冰凍包埋 是作冰凍切片的包埋方法. 新鮮的及以固定的材料均 適合于冰凍包埋. 常用的包埋劑是OCT

塑料包埋 常用的是環(huán)氧樹脂包埋劑. 優(yōu)點(diǎn)是同時(shí)可以作光鏡和 電鏡觀察

碳臘包埋 較少用.包埋劑為聚乙二醇

4. 切片

因?yàn)槊庖呓M化的步驟較多, 要求切片薄而且平整, 否則在染色過(guò)程中容易脫片.一般要求片厚在4um以下。貼片前普通的載玻片要作適當(dāng)?shù)奶幚怼?/p>

(1)洗片 酸液浸泡過(guò)夜，流水沖洗，蒸餾水洗，95%酒精浸

泡 2h，擦干。

(2)涂膠 常用的防脫片劑有：多聚賴氨酸，APES及白乳膠。

使用方法見試劑使用說(shuō)明書。

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